RNA: 主要由四种核糖核苷酸组成,即腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)。 天然的RNA并不象DNA那样呈双螺旋结构,而是单链线形分子。只有局部区域为双螺旋结构(约占RNA分子的50%)。 RNA分子中的核苷酸至少75个,多的可达数千个。 RNA的分类:(1)信使RNA(mRNA)(2)转移RNA(tRNA)(3)核糖体RNA(rRNA)(4)小RNA(snRNA) 常用的RNA分析方法:(1)RT-PCR(Reverse Transcription PCR)(反) 逆转录聚合酶链反应(2)原位杂交(In situ hybridization)(3)Northern Blot(4)RNA斑点和狭线杂交(5)S1核酸酶作图法(6)引物延伸法 一、RNA的提取与纯化: (一)控制RNA酶的活性: 1、控制污染: (1)专用的RNA操作室、专用器械。 (2)操作时戴口罩、帽子、手套。 (3)实验用器皿、吸头、离心管应为新的。 (4)所配制的水溶液,尽可能用DEPC处理。 2、已污染RNA酶的器具的处理 (1)在180℃的高温下干烤8小时或更长时间。 (2)氯仿冲洗。 (3)双氧水浸泡。 (4)0.1%DEPC(焦碳酸二乙酯)水浸泡。 3、常用的RNA抑制剂: (1)焦磷酸二乙酯(DEPC):一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂,通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应从而抑制酶的活性。 (2)异硫氰酸胍:最有效的RNA酶抑制剂。在裂解组织细胞的同时,也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中分离出来,又对RNA酶有强烈的变性作用。 (3)氧钒糖核苷复合物:由氧化钒离子和核苷形成的复合物,与RNA酶结合后几乎能完全抑制RNA酶的活性。 (4)RNA酶的蛋白抑制剂(RNasin):从人胎盘中分离出来,可以和多种RNA酶结合,使其失活。 (5)其它:SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定的抑制作用。 |
(二)RNA的提取: 常用的RNA提取方法: 异硫氰酸胍法、盐酸胍法、RNAzol法。 RNAzol法的特点:方便、快速、得率高。但所用试剂价格贵,仅适用于小量提取。 组织中总RNA的Trizol法提取 1、取新鲜组织约50-100mg,加入1 ml Trizol。室温充分匀浆,静置5分钟。 2、加入0.2 ml氯仿,振荡15秒,静置2分钟。 3、4℃,12000g×15分钟,取上清。 4、加入0.5 ml异丙醇,将管中液体轻轻混匀,室温静置10分钟。 5、 4℃,12000g×10分钟,弃上清。 6、加入1 ml 75%乙醇,轻轻洗涤沉淀。 4℃,7500g×5分钟,弃上清。 7、晾干,加入适量的DEPC水溶解(65 ℃促溶15分钟)。 8、定量:在紫外分光光度计上测定OD260和OD280。 RNA样品处理: 1、变性胶配制 2、RNA样品处理 3、电泳 4、紫外灯观察 (三)RNA的纯化: 采用Oligo dT-纤维素,从总RNA中分离出mRNA.该法利用mRNA 3‘末端有Poly(A)的特点,在总RNA流经寡聚(dT)-纤维素柱时,在高盐缓冲液的作用下, mRNA被特异地结合在柱上,当逐渐降低盐的浓度洗脱时,mRNA被洗脱下来。一般而言,经过二次Oligo dT柱后,可得到较高纯度的mRNA。 二、RNA分析: (1)RT-PCR(Reverse Transcription PCR)(反) 逆转录聚合酶链反应 (2)Northern Blot (3)原位杂交(In situ hybridization) |
(一)RT-PCR: 原理:提取组织细胞总RNA,以其中的mRNA为模板,采用olig-dT或随机引物,在逆转录酶的作用下反转录成cDNA。再以cDNA作为模板,通过特异性引物,PCR扩增目的基因。 应用:分析基因的转录产物;获取目的基因;合成cDNA探针;构建RNA高效转录系统。 1、反(逆)转录酶的选择: (1)鼠源性反转录酶(MMLV) (2)禽源性反转录酶(AMV) (3)嗜热微生物反转录酶 (4)MMLV反转录酶RNase H 实变体 2、合成cDNA的引物的选择: (1)随机六聚体引物 (2)olig (dT) (3)基因特异性引物 方法: 提取组织或细胞总RNA→紫外定量→逆转录合成cDNA→PCR扩增→电泳→摄像→光密度扫描→图像分析 3、注重事项: (1)RNA的质量。 (2)非特异性扩增,设阴性对照。 (3)平台期。 (4)内参 (看家基因 house keeping gene)。 (5)DNA污染。 |
(二)Northern Blot : 原理:RNA经过变性琼脂糖凝胶电泳分离后,转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上,经过杂交,分析mRNA的大小及含量。 应用:半定量分析mRNA的含量;确定mRNA分子的大小。 方法:提取组织细胞总RNA→RNA定量→变性胶电泳→转膜→干膜→预杂交→杂交→洗膜→压片→洗片→图像分析 注重事项: (1)RNA的完整性。(2)转膜完全。(3)探针标记的效率、变性。(4)防同位素污染。(5)压片曝光时间。 探针( probe): 定义:核酸探针是指能与特定核酸序列发生特异性互补的已知核酸片段。一般而言,核酸探针带有特别的标记物。 常用的核酸探针: (1)双链cDNA ;(2)单链cDNA;(3)合成寡核苷酸;(4)单链cRNA。 探针所携带的标记物应具备的条件: (1)标记后的探针的分子结构要尽可能与原来的分子结构相同,绝不影响其碱其配对特异性,不影响探针分子的主要理化特性,尤其是杂交特性。 (2)标记探针的检测方法简便、省时、正确可靠、重复性好、敏捷度高。 (3)稳定性好、环境污染少、价廉。 常用的探针标记物: 1、放射性同位素:3H、32P、35S、125I等。 2、非放射性同位素:地高辛素、辣根过氧化酶、碱性磷酸酶等。 探针标记法:切口移位(平移)法;引物延伸法;末端标记法;体外转录法等。 探针的纯化:层析法;沉淀法。 α-32P cDNA探针标记: (1)取模板DNA 25ng在离心管中。变性,冰浴。 (2)dNTPmix制备:dGTP、dATP、dTTP等量混合。 (3)将下列反应成份混合,加入上述离心管中: dNTPmix 2.0μl、 BSA 1.0μl、 5×Buffer 5.0μl、 Klenow 酶1.0μl、 α-32P-dCTP 2.5μl. 加入双蒸水适量,使反应总体积达25μl,轻轻混匀。室温下反应1小时。 预杂交: 常用的封闭物: (1)变性的非特异性DNA;鲑鱼精子DNA;小牛胸腺DNA (2)高分子化合物:Denhardt's溶液(含葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、牛血清白蛋白等)。 杂交: (1)离子强度:6×SSC (2)DNA探针长度 (3)温度:低于Tm(熔解温度)15-25℃ (4)时间:16小时 洗膜 压片 膜的重复使用 |
(三)原位杂交: 原理:含有互补顺序的标记DNA或RNA片段(探针),在相宜的条件下与细胞内特定的DNA或RNA形成稳定的杂交体。 应用:观察目的基因或mRNA 在细胞中的定位;半定量分析其含量变化。 直接法:用放射性同位素、荧光素、酶标记的探针与细胞内靶核苷酸形成杂交体,通过放射自显影、荧光显微镜或成色的酶促反应直接显示结果 间接法:用半抗原标记探针,最后采用免疫组织化学法对半抗原定位,间接显示探针与靶核苷酸形成的杂交体。 方法: 1、玻片: 洗→酸处理→冲洗→烤→粘附剂 常用的粘附剂:多聚赖氨酸、明胶、3-氨丙基三乙氧硅烷(APES)。 原位杂交专用玻片。 2、取材、固定: (1)保持细胞结构;(2)最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平;(3)使探针易于进入细胞或组织。 3、组织切片的处理: (1)脱蜡:石蜡影响探针的穿透性。 (2)去污剂处理:增加组织通透性。 (3)蛋白酶消化:使经固定后被遮蔽的靶核苷酸探针的杂交能力。 (4)酸酐和酸处理:防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合,以降低背景。 (5)杂交缓冲液孵育:阻断载玻片或组织标本中可能与探针产生非特异性结合的位点,以降低背景。 (6)内源性生物素和酶的抑制:防止假阳性。 4、杂交: (1)探针长度:以50-300bp为宜。 (2)探针变性:95℃,5-10分钟。 (3)探针浓度: 放射性同位素:0.5ng/μl; 非放射性同位素:2ng/μl。 (4)杂交温度:应低于杂交体融解温度(melting temperature,Tm)20-30℃。 (5)杂交时间:18-24小时。 5、杂交后处理: 去除未参予杂交体形成的过剩的探针,除去探针与组织标本之间的非特异性结合,以降低背景。 6、对照试验 阳性、阴性、组织对照。 |
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