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总DNA质量检测及酶切

标签: 总DNA 酶切

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实验步骤:

1.取 10μl DNA 于 0.8% 凝胶检测;

2.将 DNA 调节浓度至 300-400 ng/μl;

3.仔细阅读将所用的任何一种酶产品说明书,熟悉反应条件及酶切的贮存浓度( 10U-50U/μl )厂家配套试剂;

4.计算据反应条件所需要的各种试剂准确用量:( 0.5 ml tube 中)

DNA(3-5μg)                 10μl

10 × buffer reaction       1.5μl

Enzyme (15 U/μl)           0.8μl (冰上)

ddH2O                       2.7μl

混匀,短暂离心;

5.37 ℃ 温浴 1-2 hrs ( 纯 DNA) 或 10 hrs (粗制 DNA );

6.加入上样缓冲液终止酶切反应,也可 65 ℃加热 10 min 使酶变性失活;

7.电泳检测酶切效率:

每个样品取 1/10 量用琼脂糖电泳检测,制胶及点样方法同上。

结果分析:

若水稻 DNA 呈现均匀连续分布的一片,则酶切效果好,否则需重做;

DNA 被切烂: DNA 降解,重新提 DNA ;

DNA 切不动:杂质多(多糖,蛋白质,酚类,有机溶剂等),重新纯化;

若是 BAC 克隆 DNA ,酶切后应出现多条很清晰的不同大小 DNA 带。

思考:

1.什么是酶星活性?如何避免?

2.影响酶切效率的因素?

3.EB 指示剂原理?

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