一.原理 (1) 以目的mRNA 为模板,使用Oligo dT-3sites Adaptor Primer 进行反转录反应,合成1st Strand cDNA。 (2) 使用含有KpnI、XbaI、BamH I 酶切位点的上游特异性引物和3sites Adaptor Primer进行PCR反应。 (3) 使用限制性酶(KpnI、XbaI或BamH I)对PCR产物进行酶切反应。 (4) 选用适当载体克隆PCR产物并进行DNA测序。 二.材料与方法 1 材料 肝脏RNA 2 仪器、用具 PCR仪、0.2mlPCR管、移液器 3 试剂 (1) RNase Free H2O;10×RNA PCR Bμffer;MgCl2(5mM);RNase Inhibitor(40μ/μl);Oligo dt-3sites Adaptor Primer(2.5μM);AMV Reverse Transcriptase XL(5μ/μl) (2) ddH2O;10×PCR Bμffer;MgCl2(25mM);3 sites Adaptor Primer(20μM);TaKaRa Taq酶 4 方法 (1) 1st strand cDNA的合成 反应条件:30 ℃ 10min;55℃ 30min;95℃ 5min;5℃ 5min。 (2) PCR反应 ① 1st PCR反应 a. 反应体系: b.按以下条件进行反应:PCR扩增反应条件:94℃预变性3 min;然后进行30个循环反应,其温度循环条件为:94 ℃ 变性1 min ,55℃ 退火1 min,72 ℃延伸1 min;循环结束后 72 ℃ 再延伸5 min。 ② 2nd PCR a.反应体系:反应 b.按以下条件进行PCR反应:PCR扩增反应条件:94℃预变然后进行30个循环反应,其温度循环条件为:94 ℃ 变性1 min,1min,72 ℃ 延伸1 min;循环结束后72 ℃延伸5 min。c.反应结束后,取 PCR 反应液(5-10μl)进行琼脂糖凝胶电。 (3) 将2nd PCR 产物在 1% 琼脂糖凝胶上进行电泳分离。回收纯化电泳pMD-18T载体,进行鉴定和序列分析(方法同实验六、实验七)。 (4) 获得cDNA 3’末端序列后,将其与cDNA 的核心片断进行序列拼接。 |
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