[原理]

DNA 限制性内切酶消化是基因分析中的关键步骤。内切酶是最关键的工具酶。限制性内切酶是一类具有严格识别位点,并在识别位点内或附近切割双链DNA 的脱氧核糖核酸酶。

酶单位规定为:在最适反应条件下 1 小时完全消化 lμg λDNA 的酶量为 1 个单位。需注意酶单位数是以切割线性DNA 为标准定出的。消化其它种DNA 则应根据DNA 分子大小、形状适当增加或减少所需的酶量,影响限制性内切酶活性的因素包括DNA 的纯度、缓冲液、温度及酶本身。不同的限制性内切酶对缓冲液中盐浓度的要求各不相同。一般配制高、中、低盐 3 种缓冲液,用于酶反应。DNA 甲基化,附有蛋白质或高分子量DNA 胶体溶液太粘稠均会降低内切酶的消化效率。由于在限制性内切酶消化反应中,甘油浓度超过 5 %(V / V )会抑制内切酶活性,因此在 20μl 反应体系中,甘油浓度应少于 lμl 。用 2 种酶消化DNA 时,各种酶所需盐浓度相同,则消化可同时进行;若需要的盐浓度不相同,则必须先用低盐浓度的限制性内切酶消化完后,再调整到高盐缓冲系统,加入高盐浓度的限制性内切酶,继续消化。

一定的DNA 分子的核苷酸顺序是一定的,某种限制性内切酶作用于该DNA 的切点数一定,故所得的DNA 片段数和片段的大小也一定,通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酸胺凝胶电泳分离,以标准DNA (λDNA / Hind Ⅲ或 λDNA / EcoRI )作对照,溴化乙锭染色后,测出各DNA 片段移动的位置和距离。以各标准DNA 片段的分子量对数为纵坐标,各标准DNA 片段的移动距离为横坐标,求出各样品DNA 片段的分子大小。

[ 操作 ]

l .样品DNA 的限制性内切酶消化

(1 )取 2μg 样品DNA 溶液加入 0.5ml 的 Eppendorf 管中,加 2μl 10 ×限制性内切酶缓冲液,6 ~ 10 个 U 的相应限制性内切酶,加消毒双蒸水至总体积 20μl ,于 37 ℃保温酶解 2 小时,按上述条件用适当的几种不同的内切酶进行单酶或双酶解。

(2 )在 65 ℃加热 5 分钟或用适量的 0.5 mol / L EDTANa₂ 终止反应。

2 .DNA 酶解片段的电泳分离

取DNA 酶解作品 2μl 加上样缓冲液 10μl (含溴酚蓝指示剂和甘油),在 0.8 %琼脂糖(含 0.5μg / ml 溴化乙锭)凝胶进行水平电泳,电压< 5V / cm ,时间 2 小时左右,用紫外灯观察分析。

[注意事项]

1 .分子克隆是微量操作技术,DNA 样品与限制性内切酶的用量都极少,必须严格注意吸样量的准确性及全部放入反应体系中。

2 .要注意酶切时加样的次序,一般次序为水、缓冲液、DNA 各项试剂,最后才加酶液。取液时,Tip 头要从溶液表面吸取,以防止 Tip 头沾去过多的液体与酶,待用的内切酶要放在冰浴内,用后盖紧盖子,立即放回 -20 ℃冰箱,防止限制性内切酶的失活。

3 .凡用在酶切反应中的一切塑料器皿(Eppendorf 管,Tip 头等),都要新的,最后用重蒸水清洗,湿热灭菌,置 50 ℃温箱中烘干,使用前打开包装,用镊子夹取,不直接用手去拿,严防手上杂酶污染。

4 .当样品在 37 ℃与 65 ℃保温时,要注意:

(l )防止因盖子未盖严密使水汽进入管内,使反应溶液体积大量增加,造成实验失败。

(2 )防止由于标签脱落,分不清样品类型。

5 .由于温差原因,往往在盖上有水汽,因此样品酶切完毕或中间取样电泳要离心 2 秒钟,以集中体积内溶液,否则会发现酶切后体积 少了。

[试剂和器材]

1.试剂

（1）限制性内切酶：如 EcoRI、Hind Ⅲ、PstⅡ、BamH1等，-20℃贮存。

（2）样品 DNA：如 λDNA、pBR322等，-20℃贮存。

（3）限制性内切酶缓冲浪配制，见下表（用消毒双蒸水配制，贮存于-20。C）；

（4）10×TBE电泳缓冲液:0.89 mol/L Tris；0.89 mol/L硼酸；0.02 mol/L EDTA Na2 pH8.0，高温灭菌，贮存于4℃。

（5）6×上样缓冲液：0.25%溴酚蓝；40%蔗糖；用消毒双蒸水配制，贮存于4℃。

（6）溴化乙锭溶液：称取溴化乙锭5mg溶解于lml消毒双蒸水中，4℃避光保存。

（7）消毒双蒸水。

2.器材

恒温水温箱；电泳仪；水平电泳糟；50μl可调移液器；紫外灯（上海康华生化仪器制造厂）。