核酸的分离与提取是分子生物学研究中很主要的基本技术，样品质量将直接关系到实验的成败。但是，不同的研究目的对DNA的纯度和量的要求不尽相同。目前，国际上已有许多DNA的提取方法，有较为通用的（Bendich等1980，Dellaporta等1983，Metter 1987，Murray和Thompson 1980，Rogers和Bendich 1988，Taylor和Powell 1982），有专门针对含较高多糖、多酚等次生代谢物植物的（Baker等 1990，Webb和knapp 1990，Couch和Fritz 1990，Guillemaut和Mare chal-Drouard 1992），有针对具体物种的，如棉花（Callahan和Mchta 1991）、甘薯（Baradarjan和Prakash 1991）、莲属植物（Kanazawa和Tsutsumi 1992）等。

（2）所得DNA应当完整，电泳检查时可给出精确性高、重复性好的迁移带型。

（3）所得的DNA应有足够的量。例如，要研究多个遗传标记在某一植物居群中的分离情况，也许就要求从单株植物中提取的DNA可作100次分析；而在从大量植株中筛选一个单一遗传标记时，只需在一个Eppendorf管中微量提取得到的DNA就绰绰有余了。

如果是对植物进行大规模筛选，还应当满足下面这项要求：操作程序应当快速、简便、价格低廉，并尽可能避免使用有毒试剂。

有关植物DNA提取步骤的原理，本节将从众多的DNA提取方法中，结合本实验室的体会，选择CTAB法作一简介。CTAB（cetyltriethy lammonium bromide）是一种去污剂，这种方法的原理是：一定浓度的CTAB与核酸结合并通过离心形成CTAB－核酸复合物沉淀，而多糖等留在上相中。要使CTAB－核酸复合物的分开则先溶于高盐溶液中，再用乙醇沉淀核酸，CTAB溶于乙醇中。所得核酸DNA大小为20～50kb。很少有RNA干扰，必要时也可用RNase去除残留RNA。无论是新鲜材料或经脱水处理的材料，本方法均适用。

1.1 试验条件
【药品试剂】
抽提缓冲液（2×）：
CTAB（W/V）                    2%
Tris-HCl（pH8.0）                     100 mmol/L
EDTA                                 20 mmol/L
NaCl                                   1.4 mol/L
巯基乙醇                                   2%
10%CTAB溶液：
NaCl                                   0.7 mol/L
CTAB                                 10%
沉淀缓冲液：
CTAB                                 1%
Tris-HCl（pH8.0）                     50 mmol/L
EDTA                                 10 mmol/L
巯基乙醇                                   1%
CsCl梯度溶液（每梯度）：
CsCl                                          25 g
TE缓冲液（pH8.0）           25 ml
溴化乙锭（EB）                 5 mg/ml
TE缓冲液：
Tris-HCl（pH8.0）                     10 mmol/L
EDTA                                 1 mmol/L

异丙醇溶液：向装有一定量异丙醇的瓶中加入TE缓冲液直至两相出现，然后边搅拌边加入固体CsCl，至下层TE相中出现白色沉淀，两相混匀待用

液氮

氯仿/异戊醇（24/1）

异丙醇

2%巯基乙醇

【仪器设备】

研钵和杵子

烧杯、烧瓶

硬塑离心管（30ml, 50ml, 150ml, 250ml）

高速及超速离心机

水浴

紫外分光光度计

1.2 操作程序

（1）取10g～50g新鲜植物材料，先置液氮中速冻半min，转至研钵中研磨至细粉末。

（2）将细粉末转至一个250ml的离心管中，先加入10～50ml的2%巯基乙醇，再加入等体积的煮沸的抽提缓冲液（2×），迅速混匀。

（3）将离心管置55℃水浴中保温，可轻轻搅动混合物，使离心管内稳定达到50℃，然后让混合物降至室温。 （4）加等体积的氯仿/异戊醇（24/1），轻缓地颠倒混匀，室温下12000g离心10min，上清转至另一新离心管中。

（5）向离心管中加入110体积的10%CTAB溶液，再重复第4步一次。

（6）向离心管中加入等体积的沉淀缓冲液，混匀，室温下放置至少30min。4000g离心 10min，小心去上清，加CsCl梯度溶液，在50℃水浴中用枪头轻缓搅溶沉淀。

（7）将梯度溶液上到超速离心管中，平衡后封好管，在20℃，50000g条件离心过夜。

（8）在紫外灯下转移DNA带至一离心管中，加入等体积的异丙醇溶液，轻轻混匀后静置，分层后弃上层；重复抽提几次，直至紫红色消失。

（9）加两倍体积的TE缓冲液，混匀后加等体积的异丙醇，－20℃放置1小时，4℃条件下12000g离心30min，离心后沉淀溶于适量TE缓冲液中。

（11）用紫外分光光度计检测DNA含量。

1.3 应注意的问题及其解决方法

（1）对于我国地域广大、交通落后的国情，直接从野外新鲜的样品中提取DNA是非常困难的，因此，脱水处理是在提取DNA之前保存植物材料的一种较好方法。目前，最常用的是用硅胶快速干燥保存样品，并且干燥后的组织很容易研磨成粉而有效地破碎。

（2）DNA沉淀呈棕色，且很难用限制性内切酶完全降解。

植物材料中，特别是老的或是经逆境处理的材料，含有大量的酚类化合物，这些酚类化合物氧化后易与DNA共价结合，使DNA带棕色或褐色，并能抑制DNA的酶解反应。为防止这类情况出现，可以向提取缓冲液中加入2%（W/V）的聚乙烯吡咯烷酮（PVP，相对分子质量10000）或抽提缓冲液中的巯基乙醇的浓度可以提高到2～5%。

（3）DNA已降解，在0.5%的琼脂糖凝胶上不形成清晰的条带，而只是弥散一片。

如果应灭菌的试剂都灭了菌，各种用品都经过彻底的清洗，操作按照程序和要点，一般不会出现这种问题。如果出了这种问题，植物细胞中的内源核酸酶会降解DNA。

对于高分子量DNA来说，操作过程中应该始终避免剧烈的振动；在用枪头（tip）吸取过程中应避免产生气泡，绝不能用枪（pipetman）吸上吸下地溶解DNA；使用的枪头最好要口径大的，或是剪掉枪头尖；另外，应避免重复地冻融步骤。

（5）DNA浓度、纯度和质量的估测

较纯的DNA溶液可通过测定其200～300nm范围内的紫外吸收光谱来进行定量；DNA在260nm处有一个明显的吸收峰。根据A260 值可估测浓度（1.0 A260 = 50mg/ml，1cm光程）而A260 /A280 比值则可估测其纯度（纯DNA溶液的A260 /A280 值应为1.8±0.1）

若DNA不够纯，由于RNA或非核酸类杂质的干扰，通过紫外吸收测算的数据可能会有出入。这时，可通过琼脂糖凝胶电泳加溴化乙锭染色的方法来定量。在低浓度琼脂糖凝胶（0.65%）中加入约50～100ng样品DNA，并排依次加入25～200ng未经酶解的lDNA标准，高相对分子质量DNA（Mr>50kb）应为一条靠近lDNA的清晰条带。该条带以下的片状模糊时机械或化学降解，更为靠近胶底部的模糊条带则是样品DNA中混杂的RNA。 比较样品DNA条带与lDNA标准条带的亮度即可对样品DNA进行定量。