[目的]

掌握双脱氧链终止法测定DNA序列的原理与方法

[原理]

DNA聚合酶催化的DNA链延伸是在3’-OH末端上进行的。由于2’，3’-双脱氧三磷酸核苷酸(ddNTP)的3’-位脱氧而失去游离-OH，当它参入到DNA链后，3’-OH末端消失，使DNA链的延伸终止。

本实验根据此原理，将待测DNA片段插入单链噬菌体M13载体，并用合成的寡聚核苷酸引物与该载体上插入待测片段的上游顺序退火，随后在T7DNA聚合酶催化下进行延伸反应。实际操作中同时进行，分别终止于A、G、C和T的4个反应体系。每个反应体系均含4种脱氧三磷酸核苷酸(dNTP)底物，其中—种dATP为32P标记物，以便能用放射自显影法读序。但在这4个反应体系中，分别加一种低浓度的ddNTP(ddATP、ddGTP、ddCTP或ddTTP)，这样ddNTP可随机参入正在延伸的DNA链上，使链延伸终止。例如在“A”管中加ddATP，反应结束时，管内所有新合成的DNA链都是以A结尾的不同长度的片段，而且这些片段都带放射性。将反应物加在高分辨凝胶上电泳，DNA片段则因其长度不同(分子量大小不同)被分离，短的走在前端，长的泳动在后面。其他3管则分别为以G，C或T结尾的不同长度DNA片段。

由于：①即使是长短相差一个核苷酸的DNA片段，亦可根据其电泳距离的差异而加以区分；②A、G、C和T4种反应体系的产物在电泳凝胶中相邻排列。故而在阅读凝胶电泳的放射自显影图像时，由下至上按前后顺序即可将DNA的核苷酸顺序读出。

[操作]

1．单链模板与引物退火

(1)用无菌蒸馏水按1：5稀释通用引物(约4.44μg/ml)。

(2)取1.5ml微量离心管1只，加入下列试剂：模板DNA(1.5-2ugDNA/10μl)10μl；稀释通用引物2μl；退火缓冲液2μl,总体积14μl。

2．链延伸/终止反应

(1)稀释T7DNA聚合酶：取2μl(或4μl)冷的酶稀释缓冲液至1只微量离心管中，加入0.5μl(或lμl)T7DNA聚合酶，用加样器轻轻抽吸和排出而混匀，置冰浴中待用。

(2)另取4只微量离心管，分别用记号笔标明“A”、“G”、“C”和“T”。依次将A-Mix、G-Mix、C-Mix和T-Mix液各2.5μl分别加入这4只微量离心管中，置37℃预温1分钟以上 (说明：4种mix液各又分为short和long两种，前者中ddNTP浓度较高，用于<500bp的DNA片段的测序，后者用于50-1000bp片段的测序。一般应用short即可)。

(3)标记反应：在操作(1)的微量离心管中加入下列试剂：模板/引物14μl(已有)；标记用混合物(1abellingmix)3μ1；已标记混合物(1abelled mix)1μ1，T7DNA聚合酶稀释液2μ1。总体积20μ1。

轻轻混匀，简短离心，置室温5分钟，立即接下步反应。

(4)从“标记反应”混合物中，分别取4.5μl加于4只预温的反应液中(注意：每一次转移均应换用新的吸头)，轻轻混匀。简短离心，37℃保温5分钟。

(5)向每只离心管中加入5μl反应终止液，混匀，简短离心。

(6)变性反应：在电泳前进行。在上述链延伸反应终止后，最好即时进行变性反应并电泳，如不能及时电泳，终止反应后样品可储于冰浴或4℃。

另取4只微量离心管，标好“A”、“G”、“C”和“T”。从上述每一链延长/终止反应的试管中取3μ1，分别加入4只已标号的相应微量离心管中，75-80℃加热2分钟，立即各取1.5-2μ1点样、电泳。

3．制备电泳凝胶及电泳

(1)制备胶模：取双块制胶玻板，先用泡沫海绵沾“洗洁净”液仔细擦洗，用水彻底淋洗，干燥后继用酒精清洗，晾干，再用硅烷剂(repel-silane)将玻板的—面擦一遍，蒸馏水淋洗，干燥 (注意：清洗时应戴一次性手套操作)。

将其中一块玻板平置台上(硅烷处理过的—面朝上)，两侧各放置一条隔离条(最好选用上方厚为0.2mm，下方厚0.4mm的楔形条)，另取—块玻板(硅烷化处理过的—面朝下)，对准放置在上述玻板上，两侧及—面边缘用胶带封严，并用文具夹夹紧，制成胶模。

(2)配制电泳凝胶：向1只100ml烧杯中加入下列试剂；20%丙烯酰胺溶液20ml；10×TBE缓冲液5ml；46.7%尿素溶液25ml。总体积50ml(凝胶的丙烯酰胺浓度为8%)。混匀，过滤除去不溶物，置100ml梨形瓶中连接水泵抽气5分钟，加入250μl 10%过硫酸铵，50μlTEMED混匀。

(3)注胶：立即将配好的凝胶用50ml注射器小心注入制好的玻板胶模中(胶模宜倾斜45度左右)，注意防止气泡，如有气泡产生，可敲击该部位玻璃，使气泡上升排除。从上面插入梳齿背，深入胶面约10-12mm。将胶模水平放置45-60分钟，待凝胶聚合。

(4)电泳：凝胶聚合后，拨掉梳齿，撕去玻板下缘胶带，用蒸馏水淋洗凝胶表面，以除去未聚合物质。将胶板装置在电泳槽上，上下槽加入缓冲液，注意排除凝胶下缘气泡。接通电源，40W预电泳45-60分钟。预电泳结束后，断电。插入样品梳，梳齿向下插入凝胶中3mm左右。用缓冲液小心冲洗每一加样小槽(齿间空隔)，用记号笔标明A、G、C和T4个小槽，每槽加入变性后的链延伸/终止液1.5-2μl。接通电源，40W恒压，电泳至示踪染料溴酚蓝至底边时切断电源。如待测片段较长而需继续点样，则等示踪染料二甲苯腈蓝称至距下缘4-5cm时切断电源，用缓冲液冲洗另一组4个加样小槽(应与前一组相隔1-2个加样小槽)，重复上样操作，然后继续电泳至第2组示踪染料溴酚蓝移至玻板下缘时断电，停止电泳。

4．放射自显影及结果分析

将凝胶板自电泳槽取下后水平放置，小心分离两块玻板，让凝胶完好地留在其中一块玻板上。可将凝胶切下一小角以示方向。

在凝胶上小心地覆盖一张厚的3号新华滤纸，移去玻板，在凝胶另一面覆盖一张保鲜膜，注意排除气泡。滤纸面朝下置凝胶干燥器中干燥。

于暗室中，将干燥的凝胶的保鲜膜面与一张X光底片的药膜面贴合，夹在增感屏盒中，置70℃或室温曝光4-16小时，然后显影、定影(按所用显影及定影剂说明进行)，水漂洗、干燥。然后由下而上读序。

[注意事项]

1．操作顺序参考表

(1)制备电泳凝胶(可在前一天下班前进行)。

(2)检查实验计划及试剂。

(3)预电泳。

(4)预电泳的同时进行引物退火、链延伸及终止反应。

(5)点样并电泳(根据需要可重复1-2次)。

(6)固定、干燥凝胶。

(7)放射自显影。

2．M13重组子的培养

(1)挑取单一的大肠杆菌集落加入3ml LB培养基中，37℃振荡培养直至A600光密度达到0.8-1.0为止。

(2)取200μl上述大肠杆菌培养物，加入含有2ml 2×YT培养基的试管中，再将插入待测DNA片段的M13单一白色噬菌斑接种其中，在37℃剧烈振荡培养至少5小时，但不宜超过8小时。

(3)通过两轮离心将细胞除去，第2轮的上清液小心转移至另一清洁试管中。存放4℃待用。

3．单链模板的分离

(1)沉淀M13：在上述M13培养物上清中，加入0.2倍体积的3.5mol/L醋酸铵/20%多聚乙二醇溶液，颠倒混匀数次，置冰浴30分钟。离心15-30分钟(11000g)可见白色噬菌体沉淀。小心除去上清液，可将试管倒置并吸去多余液体。

(2)分离纯化模板：向沉淀中加入TE缓冲液100μl，轻轻混匀使沉淀重悬，(以下步骤可在微量离心管中进行)。再加等体积酚/氯仿试剂，旋转振荡30秒，离心1分钟使分层。小心将上层液转移至另—干净离心管中。用酚/氯仿重复抽提一次并转移上层液。

加等体积氯仿，离心，转移上层液至洁净管中，并重复1次。

加1/10体积3mol/L醋酸钠(pH7.5)及两倍体积100%乙醇，混合，置干冰(或-40℃冰箱)中15分钟，离心10分钟，除去上清，加冰冷的70%乙醇lml，离心，除去上清，于真空条件短暂干燥。

加入20μlTris缓冲液溶解DNA沉淀，储于-20℃待用。

用于测序的DNA，其A260/A280光密度比值至少应大于1.7。

[试剂与器材]

1．试剂

(1)退火缓冲液：1mol/L Tri-HCl(pH7.6)，l00mmol/L MgCl2和160mmol/L DTT。

(2)通用测序引物：5’-d[CGTAAAACGACGGCCAGT]-3’，在水溶液中(5pmol/μl)。

(3)T7DNA聚合酶(8ug/μl)：在加有甘油的缓冲液中,应储于-20℃，用时吸取1份后迅速放回。稀释液可在4℃保存l周。

(4)酶稀释缓冲液：20mmol/L Tris-HCl(pH7.5)，5mmol/L DTT，100 u g牛血清白蛋白/m1，5%甘油。

(5)标记用混合物(Labelling Mix)：dCTP，dGTP和dTTP各1.375μm，333.5mmol/L NaCl。

(6)模板：l0μg单链M13mpl8DNA在50μ1Tris-EDTA缓冲液中。

(7)“A”mixshort：dCTP，dGTP和dTTP各840μmol/L，93.5μmol/L dATP，14μmol/L ddATP，40mmol/L Tris-HCl(pH7.6)，50mmol/L NaCl

(8)“G"mixshort；dATP，dCTP和dTTP各840μmol/L，93.5μmol/LdGTP，14μmol/L ddGTP，40mmol/L Tris-HCl(pH7.6)，50mmol/LNaCl

(9)"C"mixshort：dATP，dGTP和dTTP各840μM，93.5μmol/LdCTP，14μmol/L ddCTP，40mmol/L Tris- HCl(pH7.6)，50mmol/LNaCl。

(10)"T/mixshort：dATP，dCTP和dGTP各840μmol/L，93.5μmol/L dTTP，14μmol/L ddTTP，40mmol/L TrisHCl(pH7.6)，50mmol/LNaCl。

(11)终止液：溴酚蓝和二甲苯腈蓝FF各3%，l0mmol/L EDTA(pH7.5)，97.5%去离子甲酰胺。

(12)标记脱氧核苷酸：[α-32P]dATP，10mci/m1，3000ci/mmol。

说明：除试剂12购自Amersham公司外，其余上述试剂均包括在Pharmacia Biotech公司的T7SequencingTMKit试剂盒内。

(13)显影剂

(14)定影剂

2．器材

恒温加热器或恒温水浴槽；涡旋振荡器；台式高速离心机；恒功率电泳仪；测序用电泳槽(附玻板及隔离条)盖革计数器；可调式加样器；微量离心管(Eppendorf管)；胶带；剪刀；手术刀；烧杯(100ml)；梨形瓶(100ml)；水泵；注射器(50ml)；注射器针头(18号)；新华滤纸(3号)或Whatman滤纸(1号)；保鲜膜；凝胶干燥器材；抽气泵；增感屏；X光胶片；显影及定影用具。