1、低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好，平端连接需要过夜反应。

2、在体系中加一点切载体的酶，只要连接后原来的酶切位点消失。这样可避免载体自连，应该可以大大提高平端连接的效率。

足够多的载体和插入片段是最重要的 。要看片段具体情况而言，有时载体和片段浓度过高，容易产生线性化产物，不利于环化的。插入的DNA的摩尔数是载体摩尔数的5-10倍，这个很关键。载体通常50ng就够了，若载体在10k左右，可用50－100ng。

3、平端的连接对于离子浓度很敏感，回收的时候多洗洗，加PEG和扩大酶量，22度2小时后4℃过夜。

4、尽可能缩小连接反应的体积，最好不超过10微升，在5、6微升左右最佳。

5、建议放在四度冰箱连接两天效率更高比14度好。