[原理] 本法用含EDTA的溶液洗涤细胞,SDS(十二烷基硫酸钠)破碎、裂解细胞,消化蛋白质,使核蛋白解聚并使细胞内的DNA酶失活,用酚、氯仿变性蛋白质并去除杂质,最后用乙醇沉淀得到纯化的DNA。 [试剂] 1.裂解缓冲液 2.苯酚-氯仿溶液 3.氯仿-异戊醇溶液 4.冰无水乙醇及70%乙醇 5.TE缓冲液 6.5mol/L NaCl [操作] 1.处死小白鼠一只,取新鲜肝脏,用生理盐水清洗去血水。 2.每克组织加10ml裂解液制成匀浆。 3.取2ml匀浆于离心管中,加等体积苯酚-氯仿溶液,加盖,缓缓来回颠倒5min,离心2500rpm×10min。 4.取上层水相,加等体积氯仿-异戊醇溶液,加盖,缓缓来回颠倒5min,离心2500rpm×10min。 5.取上层水相至玻璃管内,加5mol/L NaCl至终浓度为0.3mol/L(2ml 100μl,3ml 150μl)。 6.加2.5倍体积的冰无水乙醇,加盖,缓慢摇匀,见白色絮状沉淀DNA出现。 7.用玻棒捞起DNA沉淀置于试管中,用1mlTE溶解。 8.定量 吸取DNA溶液100μl 2.9mlTE(30倍稀释),在260nm和280nm下读取吸光度值, 9.计算 DNA浓度(ug/ml)=A260 nm×50×1/光径×稀释倍数 |
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