实验目的

学习和掌握限制性内切酶的特性

掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法

并理解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具。

相关基础知识

限制性核酸内切酶：是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。它是基因工程中用于体外剪切基因片段的重要工具酶。

上世纪七十年代，当人们在对噬菌体的宿主特异性的限制-修饰现象进行研究时，首次发现了限制性内切酶。首批被发现的限制性内切酶包括来源于大肠杆菌的EcoR I和EcoR II，以及来源于流感嗜血杆菌(Heamophilus influenzae)的Hind II和Hind III。这些酶可在特定位点切开DNA，产生可体外连接的基因片段。研究者很快发现内切酶是研究基因组成、功能及表达非常有用的工具。

1)寄主控制的限制与修饰现象

限制与修饰系统是细菌细胞的一种防卫手段。各种细菌都能合成一种或几种能够切割DNA双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源DNA存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自身的DNA不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酶，对自身的DNA进行了修饰，限制性酶对修饰过的DNA不能起作用。这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。

2)限制性核酸内切酶的类型及特性

按限制酶的亚基组成和切断核酸情况 的不同，分为三类：

Ⅰ型

Ⅱ型*

Ⅲ型

第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，它们在识别位点很远的地方任意切割DNA链，其切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如Eco B、Eco K等。

第三类（III型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对也不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此也不能应用于基因克隆。

第二类(II型)限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。

这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的。这种酶的切割可以有两种方式：

粘性末端 ；是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。

各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。

平头末端：

II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如EcoRV 的识别位置是：

3）同裂酶和同尾酶：

同裂酶：有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序和切割位置都相同，这些有相同切点的酶称为同裂酶（同切酶或异源同工酶）。

同裂酶差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。例如Hpa Ⅱ和MspⅠ的识别顺序都是

5’……G| CG G……3’

3’……G GC| G……5’

如果其中有5’-甲基胞嘧啶，则只有Hpa Ⅱ能够切割。

同尾酶：

有时两种酶切割序列不完全相同，但却能产生相同的粘性末端，这类酶被称为同尾酶

同尾酶的切割产物可以通过DNA连接酶将这类末端连接起来，但原来的酶切位点将被破坏。

4)限制性核酸内切酶的命名法

用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄主菌的物种名称，如E.coli 用Eco表示，所以用斜体字。

用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌(Heamophilus influenzae)Rd菌株用d，即Hind。

如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制与修饰酶，则以罗马数字表示，如Hind Ⅰ,Hind Ⅱ，Hind Ⅲ等。

3.酶切反应的设计一般应注意问题:

1)大多数限制酶贮存在50%甘油溶液中，以避免在-20℃条件下结冰。当最终反应液中甘油浓度大于12%时，某些限制酶的识别特异性降低，从而抑制酶活性。因此加入反应的酶体积不超过反应总体积的10%。

2)反应混合物中基因组DNA底物的浓度不宜太大，小体积中过高浓度的基因组DNA会形成粘性DNA溶液,从而抑制酶的扩散，并降低酶活性。建议酶切反应的基因组DNA浓度为0.1-0.4μg/μl。同时RNA应该尽量消化去除。

3)当要用两种或两种以上限制酶切割DNA时，必须选择好通用缓冲液，则两种酶才可同时切割。

4)酶切底物DNA应具备一定的纯度，其溶液中不能含有迹量酚、氯仿、乙醇，大于10mM的EDTA，SDS以及过量的盐离子浓度，否则会不同程度地影响限制酶的活性。

5)反应混合液中加入浓度为0.1mg/ml的BSA，可维持酶的稳定性。

4.酶切实验中的注意事项:

1)反应取酶时应使用无菌吸头，以免污染酶液，同时应尽量缩短酶在温室的放置时间。

2)反应混合物混匀时，应避免强烈振荡以保证不使内切酶变性及DNA大分子的完整。

3)反应前的低速离心是必要的，这可使因混匀吸附于管壁上的液滴全部沉至管底。

4)终止酶反应可根据需要采用不同的方法：

①酶切后不需进行下一步反应，可加入含EDTA的终止液终止反应。

②若需进一步反应(如连接，切割等)，可将反应管置65℃保温20-30分钟，以灭活酶，终止反应。

③可用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。

5.酶切实验设计的一般思路:

6.实验材料与仪器

•质粒 pUCm-T-TaSTK

•RNase

用含有10mmol/LTris-HCl、15mmol/L NaCl溶液溶解Rnase到10mg/ml，沸水浴15min，保存到-20℃

•SacI 和 XbaI 核酸内切酶（Takara）

•酶解缓冲液(10×M buffer)

•离心机，水浴锅

•10ml，50ml微量移液器，无菌的1.5ml EP管

实验方法和步骤

1)质粒中RNA的酶

向30ml质粒溶液中加入10mg/ml Rnase 2ml，37℃水浴酶解0.5小时。

2)质粒DNA的限制性内切酶酶

Total ddH₂O M Buffer SacI XbaI 质粒DNA

20ml 13ml 2ml 1ml 1ml 3ml

置于37℃水浴酶解16小时。酶解完成后，分别加入10倍的上样缓冲液,然后各取15ml进行电泳分析。