(一) 原理
目前用于抗体标记的荧光素主要有异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocynate,FITC)或罗达明(Lissamine rhodamine B200, RB200)。在硷性条件下FITC的碳酰胺键可与抗体赖氨酸的ε氨基共价结合，标记后的抗体仍保持与相应抗原结合的能力。在荧光灯源紫外线或兰紫光激发下产生黄绿色荧光，通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。
(二) 操作步骤
将纯化的IgG抗体对PH9～9.5碳酸盐缓冲液透析过夜，
透析后抗体液移入小烧杯中
↓
称取适量IFTC，加入二甲亚砜(DMSO)(FITC～1mg/1ml DMSO)
使终浓度为1mgFITC／1mlDMSO
FITC／IgG比例:如IgG浓度为1mg／ml，FITC／IgG比例约为50μgFITC／mgIgG；
如IgG为5～10mg／ml，则比例为25μgFITC／ml IgG
在10ml小烧杯中先放入抗体
↓
按上述比例将FITC-DMSO溶液逐滴加入透析后的抗体溶液中
↓
将标记物用PBS加至2.5ml，磁力搅拌器室温下避光搅拌2h
↓
用PD10柱(Sephadex G25柱)除去游离荧光素，先用25ml PBS淋洗G25柱
↓
收集PBS洗脱第一个荧光素结合蛋白峰，测定F／P
比值。第二个荧光素峰为游离荧光素
计算:
2.87×A495
F／P＝────────
A280-0.35×A495
合适的F／P值为2～4。
(三) 试剂器材
1.纯化的多克隆抗体或单克隆抗体。
2.FITC(Fluorescein-5-Lsothiocyanalte)或其它荧光色素。
3.PBS、DMSO
4.PH9～9.5碳酸盐缓冲液: Na2CO34.3g，NaHCO3 8.6g加蒸馏水至500ml。
5.PD10柱(Sephadex G25柱)
6.拌器，紫外分光光度计等
(四) 注意事项
1. FITC保存于4℃暗处，使用前待试剂瓶升至室温时开盖称取，以避免潮解。
2. FITC-DMSO液要临用时配制。
3. 碳酸盐缓冲液要新鲜配制。
一、标本制作
可制作涂片、印片、细胞单层培养物、组织切片，经适当固定或不固定，作免疫荧光染色用。
二、荧光抗体染色方法
（一）直接法
1．染色 切片经固定后，滴加经稀释至染色效价如1：8或1：16的荧光抗体（如兔抗人γ-球蛋白荧光抗体或兔抗人IgG或IgA荧光抗体等），在室温或37℃染色30min，切片置入能保持潮湿的染色盒内，防止干燥。
2．洗片 倾去存留的荧光抗体，将切片浸入pH7.4或pH7.2PBS中洗两次，搅拌，每次5min，再用蒸馏水洗1min，除去盐结晶。
3．用50%缓冲（0.5mol/L碳酸盐缓冲液pH9.0～9.5）甘油封固、镜检
4．对照染色
①正常免荧光血清染色，如上法处理切片，结果应为阴性。②染色抑制试验（一步法）：将荧光抗体和未标记的抗体球蛋白或血清（相同）等量混合，如上法处理切片。结果应为阴性。为证明此种染色抑制不是由于荧光抗体被稀释所致，可用盐水代替未标记抗血清，染色结果应为阳性。此法结果较二步法稳定。③类属抗原染色试验，前面已作叙述。
直接法比较简单，适合做细菌、螺旋体、原虫、真菌及浓度较高的蛋白质抗原如肾、皮肤的检查和研究。此法每种荧光抗体只能检查一种相应的抗原，特异性高而敏感性较低。
（二）间接法
（1）切片固定后用毛细滴管吸取经适当稀释的免疫血清滴加在其上，置于染色盒中保持一定的湿度，37℃作用30min。然后用0.01mol/l pH7.2PBS洗两次，10min，用吸水吸去或吹干余留的液体。
（2）再滴加间接荧光抗体（如兔抗人γ-球蛋白荧光抗体等），同上步骤，染色30min，37℃，缓冲盐水洗两次10min，搅拌，缓冲甘油封固，镜检。
对照染色：①抗体对照：用正常兔血清或人血清代替免疫血清，再用上法进行染色，结果应为阴性。②抗原对照：即类属抗原染色，亦应为阴性。③阳性对照。
间接法中上述方法称双层法（Double Layer Method）。另一种称夹心法，即用未标记的特异性抗原加在切片上先与组织中之相应抗体结合，再用该抗原之荧光抗体重叠结合其上，而间接地显示出组织和细胞中抗体的存在，方法步骤如下：
①切片或涂片固定后，置于染色湿盒内。
②滴加未标记的特异性抗原作用切片于37℃，30min。
③缓冲盐水洗2次，每次5min，吹干。
④滴加特异性荧光抗体再用切片于37℃，30min。
⑤如③水洗。
⑥缓冲甘油封固，镜检。
间接法只需制备一种荧光抗体可以检出多种抗原，敏感性较高，操作方法较易掌握，而且能解决一些不易制备动物免疫血清的病原体（如麻疹）等的研究和检查，所以已被广泛应用于自身抗体和感染病人血清的试验。
（三）补体法
1．材料
（1）免疫血清60℃灭活20min，用Kolmers 盐水作2倍稀释成1：2，1：4，1：8……。补体用1：10稀释的新鲜豚鼠血清，抗补体荧光抗体等，按下述的补体法染色。免疫血清补体结合的效价，如为1：32则免疫血清应作1：8稀释。
（2）补体用新鲜豚鼠血清一般作1：10稀释或按补体结合反应试管法所测定的结果，按2单位的比例，用Kolmers盐水稀释备用。Kolmers盐水配法：即在pH7.4、0.1mol/L的磷酸缓冲盐水中，溶解MgSO4的含量为0.01%浓度。
（3）抗补体荧光抗体：在免疫血清效价为1：4，补体为2单位的条件下，用补体染色法测定免疫豚鼠球蛋白荧光抗体的染色效价，然后按染色效价1：4的浓度用Kolmers盐水稀释备用。
2．方法步骤
（1）涂片或切片固定。
（2）吸取经适当稀释之免疫血清及补体之等量混合液（此时免疫血清及补体又都稀释一倍）滴于切片上，37℃作用30min，置于保持一定湿度的染色盒内。
（3）用缓冲盐水洗2次，搅拌，每次5min，吸干标本周围水液。
（4）滴加经过适当稀释之抗补体荧光抗体30min，37℃，水洗同（3）。
（5）蒸馏水洗1min，缓冲甘油封固。
3．对照染色
（1）抗原对照。
（2）抗血清对照：用正常兔血清代替免疫血清。
（3）灭活补体对照：将补体经56℃30min处理后，按补体同样比例稀释，与免疫血清等量混合后，进行补体法染色。
本法之荧光抗体不受免疫血清的动物种属的限制，因而一种荧光抗体可作更广泛的应用，敏感性亦较间接法高，效价低的免疫血清亦可应用，节 省免疫血清，尤其是对检查形态小的如立克氏体、病毒颗粒等或浓度较低的抗原物质时甚为理想。
（四）膜抗原荧光抗体染色法
本法应用直接法或间接法的原理和步骤，可对活细胞在试管内进行染色，常用于T和B细胞、细胞培养物、瘤细胞抗原和受体等的检查和研究，阳性荧光主要在细胞膜上。FACS即采用此法原理。
（五）双重染色法
在同一标本上有两个抗原需要同时显示（如A抗原和B抗原），A抗原的抗体用FITC标记，B抗原的抗体用罗达明标记，可采用以下染色方法：
1．一步法双染色 先将两种标记抗体按适当比例混合（A+B），按直接法进行染色。
2．二步法双染色 先用RB200标记的B抗体染色，不必洗去，再用FITC标记的A抗体染色，按间接法进行。
结果：A抗原阳性荧光呈现绿色，B抗原阳性呈现桔红色荧光。
（六）荧光抗体再染色法
若切片或其他标本经某种荧光抗体染色后，未获得阳性结果，而又疑有另外的病原体存在时，可用相应的荧光抗体再染色。
有时存档蜡块不能再用以切片，也可用存档的HE染色标本，褪去盖片和颜色，再作免疫荧光或其它免疫细胞化学的染色。
三、荧光抗原染色法
某些抗原可以用荧光素标记，制成荧光抗原，标记荧光素的方法与制备荧光抗体方法相同。用荧光抗原可以直接检查细胞或组织内的相应抗体，特异性较好，敏感性较差。染色方法同荧光抗体染色的直接法。由于多数抗原难以提纯或量少不昂贵，一般很少采用此法。
组织的非特异性染色的机理很复杂，其产生的原因主要可分为以下几点：
（1）一部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。
（2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分结合。
（3）除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原（如Forssman氏抗原），可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结合。
（4）从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体，以致容易混淆。
（5）抗体分子上标记的荧光素分子太多，这种过量标记的抗体分子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。
（6）荧光素不纯，标本固定不当等。
消除荧光抗体非特异性染色的方法应根据产生的原因采取适当的方法，常用的方法有以下几种：
（一）动物脏器粉末吸收法
常用肝粉（猪、大白鼠或小白鼠），其次是骨髓粉、鼠脑粉和鸡胚粉等。每毫升荧光抗体中加入肝粉50～100mg,在离心管中充分混匀，在室温中振动2h，4℃中过夜，再搅拌10min，高速离心（3000～15000r/min）30min，1～2次后，即可使用其上清液。吸收一般应在临用前进行，吸收后之荧光抗体保存冰箱中勿超过2周。染色应作吸收前后之比较，吸收时可先用缓冲盐水将组织干粉浸湿，离心（3000～15000r/min）30min，除去上清液，再加入荧光抗体进行吸收，以免消耗过多的抗体。
肝粉或新鲜细胞吸收是一种非特异性的消除方法，对荧光抗体的荧光色素和蛋白都有吸附作用。如检查组织中的病毒抗原时，也可用相同的组织干粉或匀浆沉淀物吸收之。
用脏器肝粉吸收对荧光抗体损失较多，如果根据Hiramotos氏等的方法将组织的20%生理盐水匀浆液，用生理盐水洗2～3次，12000r/min 10min离心沉淀，用其沉淀物吸收其荧光抗体即能完全达到目的，京极方久氏认为这样吸收对荧光抗体几乎没有损失，他们常用此法，效果甚佳，吸收后放置一周左右，用时有必要再吸收一次。
【肝粉的制法】
（1）将若干只小白鼠或大白鼠放血杀死，取出肝脏，用生理盐水洗2～3次，除去血液，剥掉表面的结缔组织的脂肪。
（2）剪碎，用生理盐水反复洗涤至无血色止，然后再加生理盐水少许，用组织捣碎机或匀浆器作成匀浆。
（3）将肝匀浆装入离心管内（1/3左右），交换地用2～3倍量生理盐水和丙酮反复洗涤各三次，至上清无血色止，每次完毕先用2000r/min离心沉淀15min后，再除去上清液。
（4）最后用丙酮洗涤肝浆，再用布氏漏斗过滤，或离心沉淀，将沉淀物平铺在洁净的玻璃板上，37℃烤干（过夜）。
（5）在乳钵中充分研磨，用120目铜筛筛选过后，分装，密封，低温干燥保存。
（二）透析法
荧光素如FITC分子可以通过半透膜，而蛋白质大分子不能透过，可将未与蛋白结合的荧光素透析除去。
（1）将标记完毕的荧光蛋白液装入一透析袋或玻璃纸袋内，液面稍留空隙，紧扎。
（2）浸入0.02mol/ph 7.1～7.4的PBS中（悬于大于标记物体积约50～100倍的PBS内），在4℃中透析，每日更换3～4次PBS，约5～7天，透析液中无荧即可（在荧光光源照射下）。
（三）葡聚糖凝胶G-50柱层析法
除游离荧光素可用2×46cm柱层析法，详细方法参阅第二章 。加入荧光抗体15～18ml（按床体积的5%～10%加样），使其缓慢渗入柱内，待即将全部入柱时，加入PBS少许，关闭下口，停留30～40min ，使游离荧光充分进入细筛孔中，然后再接通洗脱瓶开始滴入洗脱液。加入洗脱液一定量后，荧光抗体即向下移行，逐渐与存留于上端的游离荧光素之间拉开明显的界线，随着大量洗脱液的不断加入，二者分离距离越来越大，荧光抗体最先流出，分前、中、后三部分收集，测F/P比值，合格者合并，浓缩，分装。洗脱液用20%磺基水杨酸测定蛋白（发生沉淀反应），继续洗脱，游离荧光素则相继被洗脱下来，至洗脱液中无蛋白和荧光素后，此层析柱即可再用。
若用以除去荧光抗体中的游离荧光素和硫酸铵等盐类，可先在过柱前透析一夜，否则，NH4+太浓，在蛋白未完全洗脱时即出现NH4+，因而影响提纯与回收蛋白，一般待洗脱液出现蛋白时，即进行收集，之后出现SO4++（用1%BaCl2检查发生白色沉淀）。最后是NH4+，（用纳氏试剂检查呈黄棕色沉淀），待洗脱液无SO4++及NH4+后可再用。
如仅用小量荧光抗体，可用1×20cm的柱层析柱，取2g Sephadex G-50装柱，即可过滤2～3.5ml荧光抗体。
（四）DEAE纤维素柱层析法
标记过多或过少荧光素的抗体分子可用DEAE-纤维素柱层析法除去。方法如下：
DEAE-纤维素柱的装柱，洗脱、再生方法等与提纯IgG方法相同。装柱所需DEAE-纤维素量以干重每克交换20～50mg标记蛋白量为宜。常用梯度洗脱法如下：
（1）层析柱用0.01mol/L、pH7.2PB平衡，标记物上柱后，先用0.01mol/L、pH7.2PB洗脱，洗出无色或淡绿色液体，洗脱液量（根据床体积大小每梯度乘3），然后依下列各种离子强度洗脱液，分别洗脱和收集：
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.05mol/l NaCl）……洗脱部分1。
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.01mol/l NaCl）……洗脱部分2。
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.02mol/l NaCl）……洗脱部分3。
将此三部分收集液（每管5ml）分别测定其F/P比值，0.05mol/l NaCl pH7.2PB洗脱液280nm光密度高峰管合并，浓缩保存备用。因这部分非特异性染色荧光最少，是比较好的荧光抗体。其他两部分可以废弃。
（2）柱上吸附的过度标记蛋白可继续增加NaCl的浓度至2.0mol/L洗脱完。
经过DEAE-纤维素层析后的标记抗体，其抗体量一般约损失50%，因此有些要求不太高的抗体，如抗细菌荧光抗体，不一定要这样处理，可用染色效价测定的稀释法除去非特异性染色。
（五）荧光抗体稀释法
先测定荧光抗体特异性染色与非特异性染色的效价，若二者效价相差较大，则可将荧光抗体稀释至一临界浓度，使特异性染色呈阳性，而使非特异性染色保持阴性，稀释方法和染色效价测定方法相同。
（六）纯化抗原法
用各种方法提纯单一成分的抗原是产生单价特异性抗体的最主要条件。近代免疫化学技术（免疫吸收法）和柱层析法等提供了很大的可能性，可参考有关专著。
（七）纯化抗体法---免疫吸收法
例如抗IgA血清的纯化方法---免疫吸收法。如分泌型IgA（SIgA）抗原纯度不高，所制的抗血清常与IgG呈交叉反应，为此需要吸收，常采用纯化的人IgG戊二醛聚合物加以吸收纯化。方法如下：
1．人IgG聚合物的制备 在5ml含40mg/ml人IgG的0.1mol/l pH7.0磷酸缓冲溶液中，加入2.5%戊二醛溶液1ml，边加边搅，5min即出现混浊，逐现大块胶块，放置30min后，用研钵将凝胶磨细，继用1.0mol/l pH7.0磷酸缓冲溶液反复洗涤3次，末次加蒸馏水至20ml，即为人IgG聚合物悬液。
2．免疫吸收法 将待吸收的抗SIgG血清加入待量IgG聚合物悬液，置室温搅拌60min,离心沉淀，上清液即稀释1倍的纯化抗SIgA血清。如用IgG聚合物作少量分次吸收，其效果更好。
（八）伊文氏蓝（Evans blue）衬染法
用0.01%伊文氏蓝的0.01mol/l pH7.2PBS稀释荧光抗体，可将背景细胞和组织染色，呈红色荧光，与特异性黄绿色荧光形成鲜明的对比，减少了非特异性荧光，宜作常规应用。伊文氏蓝一般先配成1%溶液，保存于4℃，用前再稀释至0.01%用以和然释荧光抗体。
此外，还可以用胰酶消化组织切片或用10%牛血清蛋白封闭法等消除非特异性染色，提高特异性染色。
（一）材料与试剂
1．病毒株 牛流行热（BEF）北京毒株。
2．实验动物 无牛流行热的小公犊牛、健康雄性家兔。
3．被检血清。
（二）操作方法
1．特异性阳性血清的制备 以BEF强毒脱纤血给小公犊牛静脉接种10ml，出现典型症状后两周，以同样剂量做第二次接种，以后每隔一周接种一次，共5～6次，剂量分别为15ml、20ml、25ml、35ml，末次接种后2周采血清样品测效价，效价达1︰128以上时即可放血收集血清，-20℃保存。
3． 荧光抗体的制备与鉴定
（1）健康牛血清IgG的提取 取牛血清以30%饱和（NH4）2SO4提取3次，然后以少量PBS溶解沉淀，4℃透析18h，过G25柱，以0.005Mol/L pH7.2PBS液洗脱，收集洗脱液，再透析18h，以0.01Mol/L pH7.2PBS平衡4h，离心去沉淀，过DEAE纤维素柱，收集IgG，测其蛋白含量和纯度。
（2）兔抗牛血清IgG高免血清的制备 取健康家兔数只，免疫前一周分别于足掌部接种卡介苗1ml（含2mg）两侧各接种0.5ml。
牛IgG加弗氏完全佐剂乳化后，分四点（两前肢掌部及后肢股内侧皮下）各注射0.5ml，每只兔为2ml，共注射6次，每次间隔1周，第5次与第6次间隔2周。6次含IgG及卡介苗的量分别为3.4mg、4.0mg、5.2mg、7.6mg、11mg、22mg和6.6mg、5.0mg、8.0mg、7.6mg、8.8mg、10mg。
琼扩法测血清抗体效价1︰64~1︰128为合格。
（3）兔抗牛IgG高免血清IgG的制备 同提纯健康牛血清IgG法。
（4）荧光抗体的标记及鉴定 按兔抗牛血清IgG量的1/50称取异硫氰酸荧光黄，将荧光素溶于IgG溶液总量的1/10体积的0.5Mol/L pH9.6碳酸缓冲液中，再缓慢滴加在磁力搅拌器下的IgG溶液中，于18℃～20℃搅拌3h，然后将荧光抗体结合物立即通过葡聚糖凝胶G25柱，以0.005Mol/L pH7.2PBS洗脱，收集第一峰，求出F/P比值，以F/P值为2左右（各批平均比值）合格。
将荧光抗体分装于安瓶中、封口、并置 -40℃保存。
3．抗原标本片的制备 将BEF病毒接种于BHK21细胞，当CPE达70%～90%以上时，将细胞刮取下来，以1 000r/min离心5min，去上清，加入灭菌盐水，再离心5min，以沉淀的染毒细胞作抗原标本涂片，自然干燥后，丙酮（室温）固定10min，PBS液洗一次，再用去离子水洗一次，吹干，即可染色，不染色的抗原标本置4℃保存。以同样方法把未接毒的细胞制成抗原对照标本片。
4．染色方法 取制备的抗原标本片及对照标本片，将经生理盐水作10倍稀释的特异性阳性血清、阴性血清分别滴加在抗原标本和对照标本上，置湿盒37℃温育30min～45min。以0.01Mol/L pH7.2PBS洗3次，每次3min，再用无离子水冲洗一次，吹干。以0.2%伊文斯兰稀释成1︰16～1︰32的荧光抗体滴加于抗原标本上，置湿盒37℃温育30min～45min，然后按上法处理吹干，以碳酸缓冲甘油封表。
（三） 结果判定
于荧光显微镜下观察，阳性结果：细胞膜呈明亮的黄绿色荧光，细胞核呈棕褐色，背景呈暗褐色；阴性结果：不出现荧光。
（一）材料与试剂
1．猪瘟荧光抗体 由指定单位购买，按说明书稀释使用。
2．0.01Mol/L pH7.2PBS液
3．缓冲甘油 优级纯甘油9份和碳酸盐缓冲液1份混合而成。
4．碳酸盐缓冲液：
0.5Mol/L 碳酸钠 1份
0.5Mol/L 碳酸氢钠 3份
混合即可。
5．荧光显微镜
6．冰冻切片机
（二）操作方法
1．组织切片制作 取新鲜的扁桃体与肾组织块，用冰冻切片机制成5μm~7μm原冰冻组织切片，粘于清洁的载玻片上（0.8 mm ~1.0mm），空气中自然干燥后，立刻在室温下放入纯丙酮固定15min，取出后PBS液轻轻漂洗数次，自然干燥后染色。如不能及时染色，可用塑料纸包好，放入低温冰箱中保存。
2．荧光抗体染色 滴加猪瘟荧光抗体（工作浓度）2~3滴，以覆盖为度，放入湿盒中，37℃感作30min（切忌染色液干涸）。以PBS液3×3min冲洗。
3．染色片半干时，滴加缓冲甘油封片，置荧光显微镜下观察。
4．对照的设置 将组织切片固定后，滴加猪瘟高免血清，37℃感作30min，冲洗后，以猪瘟荧光抗体染色。
（三）结果判定
将染色好的组织片置激发光为蓝紫光或紫外光的荧光显微镜下观察。
阳性结果：扁桃体隐窝上皮细胞或肾曲小管上皮细胞的胞浆内呈明亮的翠绿色荧光，细胞形态清晰。
阴性结果：无荧光或荧光微弱，细胞形态不清晰。
试验材料：
（1）抗原片：家鼠型和姬鼠型汉坦病毒标准毒株感染Vero E6或Vero细胞制备，低温干燥保存；
（2）阳、阴性对照：单克隆抗体或确诊阳性患者恢复期血清（阳性对照）、阴性血清；
（3）羊抗人（或兔抗人）IgG荧光抗体；
（4）常用稀释液：pH7.2～7.4PBS、伊文思兰等；
（5）荧光显微镜。
检测步骤：
（1）用pH7.4，0.02mol/L PBS稀释待检血清，从1:20开始做2倍或4倍连续稀释至需要的稀释度。
（2）取出抗原片，用蒸馏水漂洗后，冷风吹干。
（3）用加样器依次从高稀释度到低稀释度逐个加入已稀释的待检血清，加入量以覆盖细胞抗原面为准（若为双份血清，最好上排为急性期血清，下排为恢复期血清），在37℃水浴箱湿盒孵育30～40分钟（每次试验同时设阳、阴性对照）。
（4）用PBS震荡洗涤3次，每次5分钟，再用蒸馏水洗涤1次脱盐，冷风吹干。
（5）用含1：3万的伊文思兰PBS按工作浓度稀释荧光结合物，滴加各孔（以覆盖细胞抗原面为准），在37 ℃水浴箱湿盒孵育30分钟，然后同（4）洗涤、漂洗、吹干。
（6）荧光显微镜观察结果。
结果判断：
细胞内病毒特异性荧光为黄绿色颗粒，分布在感染细胞的胞浆内。根据特异性荧光颗粒多少、荧光亮度、阳性细胞在细胞总数中所占比例，可将免疫荧光反应大致区分为1～4个“+”。
可参考阳性细胞数：<25%为“+”，25%～50%为“++”，51%～75%为“+++”，>75%为“++++”；无特异性荧光者为“—”（阴性）。
检测抗体滴度时，以能观察到明显特异性荧光反应（>“+”）最高血清稀释度的倒数表示。
意义：
阳性结果，表明曾受到汉坦病毒感染，>1：20有诊断参考意义；
恢复期血清抗体滴度比急性期抗体滴度有4倍或4倍以上升高则可确诊。
G 免疫荧光实验举例：免疫荧光法检测鼠肺抗原
材料：
（1）鼠肺；
（2）荧光素标记抗汉坦病毒单克隆抗体
（3）荧光显微镜。
方法：
（1）组织片制备：冷冻切片机切片，吹干，冷丙酮固定10分钟，PBS冲洗2次，蒸馏水漂洗1次，吹干，-20℃保存备用；
（2）组织片吹干，滴加荧光素标记单克隆抗体，设两孔对照，分别加荧光素标记的非汉坦病毒单克隆抗体和PBS，置湿盒内37℃水浴30分钟；
（3）取出，用PBS冲洗3次，蒸馏水漂洗1次，吹干；
（4）荧光显微镜观察结果。
结果判断：
特异性免疫荧光呈黄绿色颗粒，分布在鼠肺上皮细胞胞浆中，正常组织细胞呈橙红色或暗红。
意义：阳性结果，说明宿主动物带毒。
