一、 总RNA的提取

1、  取组织10-50毫克，剪切成大小在0.5厘米以内的碎片，加入×5的RNA later（约2毫升）。样品在37度可保存1天。室温下1周，4度下1个月。

2、 匀浆：

用Rnase Erase spray（ICN）清理匀浆器头部（7mm），用DEPC水和乙醇清洗，将上述样品用镊子转移到消毒过的（无菌）盛有500微升tripure的管中，开始匀浆。将匀浆液转移到Eppendorf doff中，另用500微升的tripure清洗管并且一并转入到Eppendorf doff中，然后用DEPC水和乙醇清洗清理匀浆器头部，防止样品交叉污染。

3、样品在室温下静置5分钟。

4、每管加200微升三氯甲烷（氯仿），轻轻混合均匀，室温下静置培养15分钟。

5、离心。4度，12 000g，15分钟。

6、离心后，可见到三层：上层没有颜色。中间层是白色。底层是红色。用1毫升的吸管小心将无色的上清液转移到另一个Eppendorf doff中，保留白色和红色用于DNA和蛋白分析。

7、每管加500微升异丙醇，轻轻混合均匀，室温下静置5-10分钟。

8、离心。4度，12 000g，10分钟。

9、用1毫升的吸管弃去上清液，用75%乙醇清洗沉淀物，小心搅拌，尽量使沉淀物能够漂浮在乙醇上面。

10、离心。4度，7 000g，5分钟。

11、用1毫升的吸管弃去上清液，在空气中干燥10分钟。

12、用甲酰胺（做Northern）或者DPEC水（做RT-PCR）清洗沉淀物，剂量依RNA沉淀物的多少而定（范围为50-500微升），样品在55-60度下加热10分钟。然后保存在-80度冰箱中备用。

二、RNA凝胶和浓度检测

检测RNA的质量：检测18s和28s核糖体RNA，样品含总的RNA-rRNA、tRNA、mRNA。

1、1.2%检测胶（check gel）（100毫升）

Agrose：       1.2g

10×MOPS     10ml

DEPC H₂O     74ml

混合均匀，用微波炉加热溶解，然后稍微冷却。再加16 ml甲醛，混合均匀后，将溶液转入凝胶容器中，发生聚合作用，约20分钟。

当胶发生聚合作用后，加入1*MOPS将胶封住。

2、 Loading Buffer  ：200ul（每个样品10 ul）

10×MPOS    20 ul

甲醛        32 ul

甲酰胺       100 ul

Dye          40 ul

DEPC H₂O    8 ul

Dye ： 0.2% 溴苯酚蓝  50%甘油（丙三醇） 1m MEDTA

对于检测胶：加1-2 ul  EB，以便于样品在UV光可以看清楚，可以看到两条带，18s：1，900bp和28s：4，900bp。

但是对于Northern胶，则不需要加EB。

3、RNA浓度检测，将样品保持在冰块中。

光谱光度测量：石英玻璃杯中，加样品4 ul，996 ul  DEPC H2O，混合均匀后，读取OD值。

型号：光度计

在2个波长260nm和280nm下读取OD值。

比率（A260/A280）表示质量（一般在1.5），A260表示数量。

计算：在260nm波长下，1 OD=40ug/ml

0.229×40=9.16ug/ml

样品稀释度为1：250（4 ul：1 ml）

9.16×250=2290 ug/ml=2.29mg/ml

为了防止样品检测的相互污染，石英杯要用DEPC H₂O清洗，并且用吸水纸吸干。

三、RNA电泳

1、样品准备

5 ug RNA +10 ul Loading Buffer

例如：RNA浓度为2.29mg/ml

所以5 ug/2.29=2.18 ul

即2.18 ul样品+10 ul Loading Buffer

65度，加热，15分钟，变性。

变性后将样品至于冰块中，

2、样品loading

在胶的下面放一块黑色的底片，可以看清楚背面。

在转移的过程中间不能有气泡。

电压：90-110V，30分钟。

RNA是负性变化的，所以它从负极（黑色）跑向正极（红色）。

3、跑胶：

1.2% Agrose 胶 300 ml

Agrose       3.6g

10×MOPS    30ml

DEPC H₂O   222ml

混合均匀，用微波炉加热，加甲醛 48 ml，冷却后转入到凝胶容器中，发生聚合作用，约20分钟。

当胶发生聚合作用后，加入1*MOPS封胶。

4、Loading buffer（10ul每个样）

注：  不加EB

5、样品准备

将样品保持在冰块中。

5ugRNA+ 10ul loading buffer

3等份分装  Eppendorf doff 中  （1） 检测   （2）28s 或者Actin  （3）有用的RNA

变性：65度，10分钟，然后将样品放到冰块中。

Prepare letter：：  1-2ul  letter+10 ul loading buffer

Loading 样品

小心将样品转移到泳道中，吸管头部不能有气泡

电压：90-120V，1小时。

四、Blotting （transfer）

将电泳胶剪切下来检测RNA。

（1）检测RNA：在胶中加入EB染色。

（2）28S和有用的RNA：

加 0.05N  NaOH，20分钟。

DEPC H₂O清洗 2-3分钟。

20×SSC  浸泡20分钟。

准备尼龙膜3张和滤纸

转膜：从底部开始

塑料薄膜

滤纸：大小可以盖住20×SSC

胶： 正面向下，以便RNA可以贴着膜，在胶的周围用电影胶片围着。

尼龙膜：一旦用了，就不能够移动了。

滤纸三层：与胶的大小一致。

纸巾：5-8厘米厚。

将上述物品固定后，在上面压一块重物，过夜（或者至少要8小时）

第二天：

将上述物品揭开，将胶正面朝下，膜正面朝上，用铅笔作好标记。

将胶浸泡在EB中1-2分钟，用DEPC H₂O清洗，将膜放在滤纸上面，夹好，4度下保存，或者直接进行预杂交。

UV杂交（有助于RNA结合到膜上面）。

五、预杂交和杂交

预杂交和杂交 buffer： 100ul

20×SSC              25ml （5×SSC）

甲酰胺               50ml （50%）

N-lauroylsarcosine：      0.1g（0.1%）

20%  SDS            100ul（0.02%）

blocking reagent         2g（2%）

DEPC  H₂O            25ml

（一）预杂交：

预杂交buffer 在55-65度下加热，温度取决于探针的质量。如果温度低，则会得到更多非特意的条带：对于周探针较好。如果温度高，则会得到高结合力的条带：探针较好。

把膜装进一个塑料袋中，RNA在一边，密封。

在预杂交buffer中培养，55-65度，轻摇，过夜。越长越好。但是要确保溶液盖到膜。

（二）杂交：

buffer 在55-65度下加热，弃去塑料袋中的预杂交buffer，将探针buffer装进，55-65度下培养过夜，轻摇。

注意：预杂交和杂交都是在同一温度下进行。

杂交后：

1、 清洗：室温下用2×SSC，0.1%SDS清洗，5分钟，2次。

2×SSC， 0.1%SDS

10 ml    20×SSC

500ul    20%SDS

加DEPC  H₂O  至100 ml

2、 清洗： 55-65度，用0.1-0.5 SSC清洗2次，每次15分钟。

SSC buffer 的浓度、温度取决于探针的质量。浓度越低、温度越高，则会得到更高的效果。

Buffer在使用之前要先加热。

3、清洗

室温下用1×MA-T清洗，1分钟，1次。

1×MA-T

100ml   10×MA

900ml   DEPC  H2O

3ml     Tween 20 （占总的0。3%）

10×MA（室温下储存）

1M    顺丁烯二醛

1.5M     NaCl

不容易溶解，可以加入70gNaOH  调节到1L。并且调节PH=7。5

4、阻断：

室温下blocking buffer，30  min

blocking buffer

1g     阻断剂

100ml  1×MA-T

稍微加热充分溶解。

5、DIG- Ab

室温下用Ab- blocking buffer，30  min

Ab ：blocking buffer=  1：5，000

重要：抗体离心后取出上清液

6、清洗

室温下用1×MA-T清洗，15分钟，2次。

7、检测

（1）将膜用 detection  buffer  培养2-3分钟，即清洗一遍。

detection  buffer

100mM    Tris-HCL

100Mm    NaCl

PH=9.5

（2）将膜取出，置于塑料薄膜上。

（3）用适量的CDP-Star（约1毫升），将膜均匀润湿，涂匀，将塑料薄膜合上，中间不能有空气和皱折。 等待5分钟。

（4）用吸水纸将膜边缘的CDP-Star吸去，用热将塑料薄膜密封。

（5）检测（暗室操作，去校医院放射科）。

（6）分析统计。